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体积排阻色谱 (SEC) 是治疗性蛋白药物聚集体和片段分析的强大工具1-3。
SEC是一种非保留分离模式,分析物基于自身流体动力学尺寸:由大到小,依次洗脱。
对于治疗性蛋白药物,聚集体在单体之前洗脱,片段在单体后洗脱。
△图1 聚集体、单体和片段依次流出
固定相孔径、孔容积和物理强度是构建高性能SEC色谱柱的关键要点: 1.治疗性蛋白药物聚集体和片段分析,最常用的SEC固定相孔径在200-300 Å范围; 2.为得到最佳分离,固定相微球(如硅胶)应具有高孔容积;与此同时,颗粒物理强度会受到影响,导致较短柱寿命,在使用过程中需要特殊关注和维护保养; 3.在保证高孔容积的基础上,需要增强固定相微球物理强度以确保SEC色谱柱的稳定性、稳健性和耐受性。 此外,SEC作为非保留分离模式,理想情况下,分析物和固定相之间不应存在相互作用,因此SEC固定相表面化学的设计和构建应确保任何次级相互作用(例如离子交换)最小化。 使用SEC分析治疗性蛋白药物时,若干要点需要关注和考虑,如下所示:
这些要点对于确保治疗性蛋白药物准确、高效和可靠的分析至关重要,特别是考虑到其复杂性和严格的药品质量标准。
以下要点将以BioCore SEC色谱柱为例,展开说明和讨论。
为实现良好的SEC分离,需要优化色谱条件,包括流动相成分。磷酸盐缓冲液是常用流动相;屏蔽不需要的蛋白与固定相之间的离子交换作用,通常在流动相中添加一定浓度的盐(常用300 mM NaCl):较低的盐浓度(例如<0.1 M)可能无法充分抑制离子交换作用,而较高的盐浓度(例如>1.0 M)可能会引起疏水相互作用。
BioCore SEC色谱柱具备独特的表面化学,确保最小的离子交换作用:溶菌酶(pI=10.2)出峰时间在不同浓度的缓冲液流动相下表现出良好一致性。在同等条件下,一款著名SEC色谱柱显示溶菌酶出峰时间随缓冲液浓度的降低而增加(如图3所示),表明该款SEC色谱柱存在显著的离子交换作用。
△图3 BioCore SEC与知名品牌SEC色谱柱次级作用力对比
SEC是非保留分离模式,需要确保分析物和固定相之间的相互作用最小化。然而,一些抗体相关生物制剂,例如抗体偶联药物(ADC),由于连接臂和小分子毒素的存在,可能会产生明显的疏水相互作用。在流动相中添加低比例有机溶剂(如乙腈或异丙醇),可能会有助于提高分辨率。如图4所示,当流动相中加入10%乙腈时,ADC单体峰洗脱时间稍早,半峰宽更窄,峰形更好。与此同时,片段可以更好地从单体峰中分离出来。
△图4 流动相中添加有机溶剂对分离的影响
精氨酸是SEC流动相的有效添加剂,可以抑制治疗性蛋白药物和固定相之间的非特异性作用,改善单体和聚集体的分离及其回收率。图5展示精氨酸和氯化钠对聚乙二醇化蛋白分离的影响:在流动相中添加300 mM精氨酸,可以观察到更高的峰响应以及单体和聚集体之间更好的分辨率。
△图5 流动相中添加精氨酸对分离的影响
在SEC模式下,流速是影响分离的关键因素之一。通常,较低的线速度将获得较高的分辨率:如图6所示,当流速从1.0 mL/min降低到0.6 mL/min,蛋白聚集体、单体和片段峰之间的分离度均得到改善。例如,片段峰峰谷比 (p/v) 从1.66增加到2.40。同时需要注意,流速不可过低,否则会出现柱外体积引起的峰展宽,对分离带来负面影响。
△图6 流速对分离的影响
为实现最佳分离,尽量减少柱外体积是另外一个要点,如管路、检测器流通池和接口等连接组件。
常规液相仪器通常适合内径为7.8 mm的SEC色谱柱;采用4.6 mm内径SEC色谱柱时,液相色谱系统柱外体积对分离变得至关重要:通常需要使用内径小于0.13 mm的连接管路和半微量流通池,以确保满意的分离度。
参考文献:
1.Fekete, S.; Beck, A.; Veuthey, J.-L.; Guillarme, D. Theory and practice of size exclusion chromatography for the analysis of protein aggregates. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2014, 101, 161-173.
2.Goyon, A.; Fekete, S.; Beck, A.; Veuthey, J.-L.; Guillarme, D. Unravelling the mysteries of modern size exclusion chromatography–the way to achieve confident characterization of therapeutic proteins. Journal of Chromatography B, 2018, 1092, 368-3783.
3.Fekete, S.; Guillarme, D.; Sandra, P.; Sandra, K. Chromatographic, Electrophoretic and Mass Spectrometric Methods for the Analytical Characterization of Protein Biopharmaceuticals. Analytical Chemistry, 2016, 88, 480-507.