【知识分享】液相色谱故障排除(一)压力问题
本文来源:LCGC(北美)杂志2021年第12期
原作者:Dwight R. Stoll
编译者:姚立新(纳谱分析总经理)
有些“LC故障排除”的主题永远不会过时,即便仪器技术随时间推移不断改进,但总有些问题在LC实操中会持续存在。接下来,我们会用系列文章去介绍液相色谱故障排除中的一些永恒主题。
下期知识分享预告:液相色谱故障排除(二)保留时间问题,敬请关注后续更新~
LC系统明面上显现出来的压力与预期值的非正常偏离是其中的一个主题,系统出现压力偏离问题的方式和原因有多种。本文将对此作一些简单的梳理,以提高我们解决和压力相关问题(太低,太高或波动)的效率。
有时压力出乎意料地低,但很稳定;有时压力过低,且还在稳步下降。压力过高的情况也是如此,有时高但稳定,有时高且还在持续升高。第三种情况,观察到的LC系统压力大致正常,但它的波动比平时更大。图1所示的产生压力问题的相关因素并非详尽无遗,本文只是把平时最常遇见的那些因素做重点介绍。
图2:标有压力和其它参数的色谱图(原文无此图,由编译者添加)
故障排除的一个重要步骤是先要确认系统是否存在一个需要排除的故障。对于压力问题,什么样的压力是正常的?是合乎预期的?一般是依据色谱理论和经验知识以及个人在实际操作中积累起来的经验感知做出判断。在LC系统中,当我们谈“压力”时,实际上是在谈论“压降”或“压力差”,在各种方程中是用符号“ΔP “表示”压降“,以及ΔP与其它变量(如流速等)的关联关系。大多数市售的LC系统是报告系统进口色谱泵头的压力读数,而系统出口(检测器流通池的出口端)的压力是一个大气压(约1 bar),与LC工作压力相比可以忽略,可以近似看作是0,这样我们就可以把泵头的压力读数近似看作是LC系统整个流路的总”压降“,但有关流路中各单元(如过滤器,连接管,进样器和色谱柱等)对总压降的贡献比例还是不清楚的。高效液相色谱(HPLC)系统中,流动相在连接管内流动是在层流的条件下进行的,可用下面的Poiseulle定律来计算不同管材的压降(计算出来的压降数值,其精度足以满足解决故障排除问题的需要):
其中ƞ是流动相的动态粘度,F是流速,Ltub和dtub分别是管子的长度和直径。粘度会随流动相组成和温度的变化而变化,其变化规律复杂,得到准确的粘度数值不是那么简单。幸运的是,有一些免费提供的基于Web的工具可以提供方便,可为用户个性化的LC系统快速给出连接管线预期压降的估计值。
具体可参见文献:D.R. Stoll and K. Broeckhoven, LCGC NorthAm. 39(6), 252–257 (2021) 和网页https://www.multidlc.org/dispersion_calculator)上的管线系统压降计算器。
液相色谱柱的压降取决于色谱柱长度、流动相粘度和流速(流动相流过填料颗粒间隙的线速率,与柱管内径和横截面面积大小无关,ue)。与上节中的方程1相比,方程2增加了量化填充颗粒床渗透率的Φ项变量和粒度大小变量dp2。
与方程1计算连接管线压降一样,一旦长度、粘度和其他变量的数值都掌握在手中,计算整个色谱柱的压降就很简单,不过准确的粘度数值并不容易获得,此时免费网络工具同样可以帮助大家计算感兴趣条件的色谱柱压降。其中有由作者领导的小组所开发维护的基于Web的LC模拟器(https://www.multidlc.org/hplcsim),以及Davy Guillarme教授的小组最近开发的基于Excel计算模拟器(见https://ispso.unige.ch/labs/ fanal/practical_hplc_simulator:en)LC系统的流路中对压降影响比较大的还有是在线过滤器(有时还有保护柱,保护柱也可处理成类似是色谱柱去计算压降)。分析型LC系统中用的商品化在线过滤器,流速小于5 mL/min的普通条件下,设计时就考虑到其对总压降的贡献一般不能超过几bar。当截留的颗粒物或碎屑开始在过滤器上积聚时,过滤器上的压降将增加,并会逐渐变得很高,压降的变化有时是非线性的,这取决于操作条件(如流速和流动相组成)。由于很难应对这种难以预测的行为,因此在我的实验室中,如果过滤器的压降超过约10 bar了,就简单更换下过滤器中的滤片即可。在John Dolan撰写的数百篇“LC故障排除”文章中,他强调了“大拇指规则”在有效故障排除中的价值。这个规则是基于理论和经验的结晶,是一种经验性的、试探性的但不是很精准的解决复杂问题的经验原则。在排查故障的过程中,一次只考察一个重要影响因素是否使系统偏离了正常,而忽略其它影响因素(如排查系统压力问题时,故意不将色谱柱接入,考察除色谱柱以外的系统流路是否正常)。我完全同意,“大拇指规则”对解决故障排除问题的指导意义和价值,我认为无论怎么强调都不为过!这里举一个我的小组运用“大拇指规则”排除LC系统压力故障问题方面的一个实例,用以下条件用来排查,“典型”LC系统在此条件下,所有连接管线(不接入色谱柱)的压降约为30 bar,如果观察到的压力远低于或高于此,即表明流路管线系统中哪里有不对劲的地方了,需要着手去发现并解决):- 从进样器到检测器的所有管线均为 0.005“ 内径(120 μm);总长度约为60 cm。从泵到进样器的毛细管线直径通常较大,对总压降的贡献不大。
- 流量:1 mL/min;环境温度;流动相:100%水相。
泄漏 在LC系统中发生泄漏的方式有很多种。最常见的与连接有关(例如,管线到阀,或管线到色谱柱)。通常这些泄漏相对较小(即每分钟几微升),可以通过稍微拧紧配件来纠正。但是,要小心,拧得太紧会损坏连接配件或使连接端口变形(如色谱柱的柱头与柱管之间的连接安装和阀口与管线的连接安装)。如果你觉得连接已经很紧密了,那么最好是先考虑换毛细管线,把旧管线扔掉换上新的管线重新开始,看是否能把问题解决了。我总是告诉我的学生,“太松总比太紧好”。再说了更换些毛细管线总比更换高压阀定子要便宜得多了。对连接过度拧紧,毛细管线会变形,还会损坏阀口上的紧固螺纹。泵柱塞和密封件之间也可能发生大的泄漏,任何情况下,在柱塞/密封件区域的泵头中是不允许有液体流出的。如果观察到液体,密封件可能泄漏,应更换。根据我的经验,这个问题并不像20年前的泵那样频繁发生。最后,PEEK管有可能爆裂,即使在低于厂家规定的压力上限下使用也可能发生爆裂,它通常会导致很大的明显泄漏,而连接部和泵密封的泄漏往往没那么明显。
溶剂入口过滤器部分阻塞 LC泵依靠从溶剂瓶到入口止回阀的自由稳定的溶剂流动来正常工作。如果溶剂瓶中管路末端的入口过滤器被颗粒物或细菌生长部分阻塞,则可能会将流动速度减慢到泵“缺乏”溶剂的程度,并且无法以指定的流速将流动相输送到色谱柱,从而导致压力低于预期。如果怀疑这可能是问题所在,快速排查的方法很简单,只需从溶剂管路中取出入口过滤器即可。如果过滤器移除后压力恢复正常,则至少需要清洗过滤器然后重新接入溶剂管路,通常过滤器堵塞这种情况发生时,最好是把溶剂入口过滤器完全更换成新的。
压力高于预期的大多数问题都与系统中某处碎片的积聚有关。这些碎片的源头各不相同,它可以来自样品中的颗粒物,也可以是原来溶于样品溶剂的一些物质分子在流动相中沉淀析出,还有一种来源是从泵和进样器密封件上脱落下来的聚合物材料。由此引起问题的性质在很大程度上取决于系统的配置方式。要确定碎片积聚造成的流路阻塞发生在系统中的具体位置可能很棘手,有种系统性的探查方法,是从最下游端开始,从流路中每次只移除一个组件,以排查问题发生在何处。例如,假设我们以 1 mL/min 的速度运行,并且我们观察到泵的压力为600 bar,与250 bar的正常工作压力相比,该压力很高。关闭流量后,从流路中取出检测器,重新打开泵并记录压力。如果它只减少了5 bar,泵压力为595 bar,那我们可知道检测器的流路并没有发生阻塞。同样,在流量关闭的情况下,取下检测器和色谱柱出口之间的管线,重新打开流量并记录压力,如果它又降低了10 bar到泵压力为585 bar,那我们知道柱出口和检测器之间的管线也不是问题的根源。
接下来,取下色谱柱,重新打开流量,并记录压力。在连接柱子和未连接柱子的情况下压力应有显著差异。假设在没有连接色谱柱时压力仍有365 bar,这在任何典型的分析LC系统中都属异常的。接下来,假设在移除紧邻色谱柱流路上游安装的在线过滤器后,压力降至20 bar,这将告诉我们过滤器本身的压降为345 bar(远高于预期),表明过滤器应该被扔掉并更换。当试图让仪器恢复正常时,这种“一次一件”的方法可能会令人感到乏味,但它是探查故障所在的最可靠方法。最常遇到的三种情况是:
在线过滤器阻塞 在我的实验室中,部分堵塞的过滤器占我们高压问题的95%。一旦过滤器很明显被阻塞,可以尝试对它反冲。但这种解决方案通常是暂时性的。从长远来看,更换过滤器要好得多。
毛细管线阻塞 如果在进样器后有使用在线过滤器(0.2–0.5 μm孔隙率),管线阻塞这种情况并不会经常发生。如果不使用过滤器,则毛细管线的直径越小越容易发生阻塞,而且是最上游端的毛细管线(即最靠近进样器)最有可能发生堵塞。反向冲洗被阻塞的毛细管线,偶尔也可清除掉碎屑积聚物,但最可靠的解决方案还是更换毛细管线。
色谱柱入口端阻塞 在色谱柱前端接入在线过滤器,可以在很大程度上防止这种情况。如果随着时间的推移观察到整个色谱柱的压降增加,反冲可以将阻塞物从柱入口端筛板中冲出。但据我的经验,用这样的方法降低压力通常是短暂的。还有我们必须注意,有些色谱柱制造商在色谱柱入口端使用了孔隙率较大的筛板,反冲会有将部分填料从筛板中冲出泄露的风险。最好的办法还是常规使用在线过滤器或保护柱(也可同时使用)来避免发生色谱柱入口端阻塞。
大多数现代的液相色谱泵都是基于往复式双柱塞设计的某些类型,其中每个柱塞行程末端发生的压力波动可以最小化,但很难完全消除。现在柱塞泵的设计规格是压力变化不应超过1%左右。如果观察到的变异远大于1%,则很可能是由于以下两个原因造成。
止回阀(单向阀)故障 典型的往复式双柱塞泵设计依赖于两个止回阀来保持流动相沿色谱柱方向移动。当溶剂从泵头向塔推出时,入口止回阀关闭,使溶剂不能返回溶剂瓶。当溶剂从溶剂瓶中抽出进入泵时,出口止回阀关闭以防止溶剂向后流入泵头。正常工作时,这些止回阀每分钟打开和关闭多次。如果其中一个或两个没有正确打开或关闭,则流向色谱柱的流量将会间隙性发生明显中断,表现出来的则是压力的改变。确定两个止回阀中哪一个出现故障可能很棘手。一种方法是:首先将进口止回阀更换为已知可正常工作的止回阀。如果这不能解决问题,重新安装回原来的进口止回阀,并用已知没问题的阀更换出口止回阀。如果这还不能减少压力波动,那说明问题不出在止回阀上。
泵头中有气泡 即使是止回阀都没问题,泵也可能被气泡连累发生问题。如果空气进到泵头中(例如,在线脱气机无法正常工作或者长时间不使用后,或者泵发生意外的干涸时),则可能导致严重的流量或压力波动。以高流速(柱子断开)清洗泵通常可有效去除气泡并恢复正常运行。如果这不能解决问题,用异丙醇清洗泵头是另一种通常效果很好的方法。
本文讨论了观察到的LC系统压力与预期或正常情况不同的情况,对此类问题进行有效的故障排除,首先必须对系统预期行为也就是系统正常值有充分的认知,以便在有明显偏离时能及时发现,并用“大拇指原则”去排查出问题和解决问题。虽然压力相关问题有许多不同的潜在原因(太低、太高或波动),但大多可能与主要的五六个特定原因有关。把这些特定原因简要列表分析,可使故障排除有个良好顺利的开端。但这种简要列表并不能把所有导致压力异常的可能因素都包括在内。
有兴趣了解更深入的原因和解决方案的读者可进一步参阅请参阅“LCGC故障排除”挂图,链接为:https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart。
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美国明尼苏达州Gustavus Adolphus学院的化学终身教授和联合讲席教授
主要研究重点是开发用于靶向和非靶向分析的2D-LC技术。
已发表论文超过75篇,在分离科学相关的已出版书籍中有四个章节他是撰写人。他做过100多场的会议演讲技术报告。目前是LCGC杂志编辑顾问委员会成员,也是“LC故障排除“专栏的编辑和主要撰稿人。