脂溶性维生素A、D和E是维持动物体正常代谢所必需的营养素，具有促进生长，提高免疫力等作用，已经广泛添加至大规模畜禽养殖所需的饲料中。

饲料中维生素ADE检测面临挑战：1.饲料基质复杂；2.维生素ADE在样品制备过程中易受光、热等因素的影响；3.维生素D3添加量低。

目前饲料中维生素A、E和D的测定方法主要参考国家标准GB/T 17817-2010、GB/T 17812-2008和GB/T 17818-2010，主要使用皂化萃取法和甲醇直接提取法：其中皂化萃取法主要针对除维生素预混和饲料以外的其他种类饲料，分析过程包括皂化、液液萃取等步骤，维生素D测定需使用反相色谱净化，整个样品分析过程繁琐、费时且试剂消耗量多。

本文介绍了一种采用在线固相萃取结合二维液相色谱（Online SPE-2D-LC），同时测定饲料中维生素ADE的快速分析方法。

样品前处理及标准品溶液制备：

样品前处理：精密称取均质后样品1~5 g，置于50 mL带刻度的棕色离心管中，加入5 mL抗坏血酸的水溶液（0.1 g/mL，临用现配），再加入15 mL含2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）的乙醇溶液（0.01 g/mL，临用现配），加盖密封后，振摇均匀，再精密加入10 mL 氢氧化钾水溶液（1 g/mL），摇匀后，置于80 ℃带震荡的水浴锅中加热皂化30 min（中间快速取出摇匀一次），取出后快速冷却至室温，然后用50%（v/v）乙醇-水溶液定容至刻度，加盖密封，摇匀，10000 rpm离心5 min，取上清液适量，采用0.22 μm尼龙滤膜过滤后，上机分析。

标准品溶液制备：准确称取VA标准品适量，用无水乙醇溶解并制成浓度为0.5 mg/mL的储备溶液；准确称取α-VE标准品适量，用无水乙醇溶解并制成浓度为1.0 mg/mL的储备溶液；准确称取VD₂标准品和VD₃标准品适量，分别用无水乙醇溶解并制成浓度均为0.1 mg/mL的标准储备溶液。分别移取各标准品储备液适量，用甲醇稀释并定容至10 mL的棕色容量瓶中，得到VADE混合标准溶液（VA: 2 μg/mL; VE: 10 μg/mL; VD: 0.1 μg/mL）。

柱温: 

柱温: 35 ℃

进样量: 50~100 μL

检测波长: 第一维: 264 nm; 294 nm; 325 nm; 

               第二维: 264 nm; 

按照确定色谱条件，维生素ADE的混合标准品溶液的典型分离谱图如下：

表4 各样品含量测定结果