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【应用分享】中药石斛的33种农残测定分析

石斛为兰科植物金钗石斛、霍山石斛、鼓槌石斛、流苏石斛的栽培品及其同属植物近似种的新鲜或干燥茎，含有较多色素类成分，中国药典2020版2341第五法中的固相萃取法三净化能力不够，需要用到纳谱分析净化能力更好的GCB/NH2-A产品。

今天，我们来看看石斛项目的前处理效果吧（以下实验样品为“干流苏石斛”）。



适用范围

本方法参考中国药典2020版2341第五法中的固相萃取法二和固相萃取法三，适用于含色素、挥发油类成分的中药材的农残检测。



实验步骤

一 / 对照品溶液的制备

1.1 混合对照品配制

精密量取禁用农药混合1 mL，置20 mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，备用；

1.2 气相色谱-串联质谱法分析用内标溶液的制备

取磷酸三苯酯对照品适量，精密称定，加乙腈溶解并制成每1 mL含1.0 mg的溶液，即得。精密量取适量，加乙腈制成每1 mL含0.1 μg的溶液。

1.3 空白基质溶液的制备

取空白基质样品，同供试品溶液的制备方法处理制成空白基质溶液。

1.4 基质混合对照溶液的制备

分别精密量取空白基质溶液1.0 mL(6份），置氮吹仪上，40 °C 水浴浓缩至约0.6 mL，分别加入混合对照品溶液10 μL、20 μL、50 μL、100 μL、150 μL、200 μL，加乙腈稀释至1 mL，涡旋混匀，即得。

二 / 供试品溶液的制备

2.1 粉碎

取干石斛样品用铡刀将其切成碎段，取碎段置粉碎机内粗粉碎，取出置开刀口的粉碎机或破壁粉碎机内细粉碎，取出过3号筛即得。

2.2 提取（直接提取法）

精密称取2.5 g样品（3号筛），加氯化钠1 g，加入50 mL乙腈，匀浆处理2分钟，离心后分取上清液，残渣再加50 mL乙腈，匀浆处理1分钟，离心后，合并两次提取上清液，减压浓缩至3 mL左右，加乙腈定容至5 mL，摇匀，待净化。

三 / 净化

GC-MS/MS样品净化：

SPE柱：SelectCore GCB/NH2-A固相萃取柱 500mg/500mg/6mL

净化：取SelectCore GCB/NH2-A固相萃取柱，用乙腈：甲苯（3：1）10 mL活化，量取上述石斛提取液2 mL，置上述已活化的固相萃取柱中，用乙腈：甲苯（3：1）20 mL洗脱，收集全部样品液与洗脱液，40 ℃水浴减压回收至2 mL，即得。


GC-MS/MS测定：

基质加标配制：精密量取上述减压回收后的样品溶液1 mL，氮吹至0.6 mL加入混合对照溶液，乙腈定容至1 mL，再加入0.3 mL磷酸三苯酯溶液，混匀，过0.22 μm尼龙针式过滤器，上机分析。

样品溶液配制：精密量取上述减压回收后的样品溶液1 mL加入0.3 mL磷酸三苯酯溶液，混匀，过0.22 μm尼龙针式过滤器，上机分析。


LC- MS/ MS样品净化：

SPE柱：SelectCore HLB固相萃取柱 200mg/6mL

净化：量取上述石斛提取液3 mL，过SelectCore HLB固相萃取柱，收集全部净化液，混匀，即得。

LC-MS/MS测定：

基质加标配制：精密量取过固相萃取柱后的溶液1 mL氮吹至0.6 mL加入混合对照品液，乙腈定容至1 mL，再加入0.3 mL水，混匀，过0.22 μm尼龙针式过滤器，上机分析。

样品溶液配制：精密量取过固相萃取柱后的溶液1 mL加入0.3 mL水，混匀，过0.22 μm尼龙针式过滤器，上机分析。

四 / 气相色谱-串联质谱法（岛津GC-MS-TQ8040 NX）

4.1  色谱条件

色谱柱：NanoChrom BP-50+MS气相柱 30m×0.25mm×0.25μm

进样口温度：250 ℃

升温程序：初始温度为60 ℃，保持1 min；       

                以10 ℃/min升温至160 ℃；

                再以2 ℃/min升温至230 ℃; 

                最后以15 ℃/min升温至300 ℃, 保持6 min；

载气：高纯氦气（纯度>99.999%）；

进样方式：不分流进样；

恒压模式：146 kPa；

进样量：   1 μL

4.2  质谱条件 

电离方式：电子轰击电离源（EI）；

电离能量：70 Ev；

接口温度：250 ℃；

离子源温度：250 ℃；

监测方式：多反应监测模式（MRM）；

溶剂延迟：10.0 min

五 / 高效液相色谱-串联质谱法（岛津LC-MS 8045）

5.1  色谱条件

色谱柱：ChromCore C18-MS Pesticides中药农残专用柱 2.6μm，2.1×100mm

流动相：

A：0.1%甲酸水溶液（含有5 mmol/L甲酸铵）

B：乙腈-0.1%甲酸水溶液（含有5 mmol/L甲酸铵）=95:5

流速：0.3 mL/min

柱温：40 ℃

进样量：2 µL

梯度：

时间

(min)

流速

(mL/min)

流动相A
(%)
流动相B
(%)
0
0.3
70
30
1
0.3
70
30
12
0.3
0
100
14
0.3
0
100
14.1
0.3
70
30
16
0.3
70
30


5.2  质谱条件

离子源：电喷雾离子源（Electrospray ionization，ESI）正离子扫描

监测方式：多反应监测模式（MRM）

离子源接口电压：4.5 kV

雾化气：氮气3.0 L/min

加热气：干燥空气10.0 L/min

DL温度：250 ℃

加热模块温度：400 ℃

接口温度：300 ℃

干燥气：N2 10 L/min

六 / 注意事项

由于干石斛质地柔韧且纤维性较强，粉碎时间应适当延长以确保样品完全粉碎且能通过3号筛，粉碎时应注意粉碎机的温度，温度过高可能导致分析结果不准确。石斛粉碎后质地较为松泡，称取5 g样品加入乙腈50 mL匀浆容易使样品成糊状，导致提取不完全，影响实验结果，故将样品称量减半称取2.5 g提取，最终定容至5 mL。

GC-MS/ MS：杀虫脒参考LC-MS/MS分析结果，久效磷参考LC-MS/MS分析结果。 

七 / 实验结果

image.png

石斛基质加标GC- MS/MS部分化合物分析结果谱图

image.png

石斛基质加标LC- MS/ MS部分化合物分析结果谱图

image.png

表1 石斛中33种农药残留的测定添加回收结果（%）

image.png


八 / 实验结论

通过以上实验数据可以看出，石斛使用SelectCore GCB/NH2-A固相萃取柱处理对其色素类成分吸附良好，有效地减轻了样品中色素成分对GC-MS/MS柱前端的污染和基质中干扰物对目标物的影响；另外使用SelectCore HLB固相萃取柱处理的石斛LC-MS/MS基质加标液中化合物出峰良好，搭配上述解决办法有效地解决了石斛中农残回收率偏低的问题，提高了实验效率，为石斛的农药残留实验数据的稳定性和可靠性提供了良好的帮助。


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