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【知识分享】高效液相色谱（HPLC）方法的开发思路经验小结
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高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography / HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”等。高效液相色谱法，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术应用。


高效液相色谱方法的开发过程中，一个总的原则是：先找到目标化合物的峰，然后调整峰形，再是进一步完善。



一. 找到目标化合物的峰

要找到目标化合物的峰，我们该如何开展工作呢？

先举一个例子，下面是分析卡比多巴的一个谱图：

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谱图上的内容主要包括：色谱柱、波长、流动相、温度、流速和进样量这几项。这意味着如果这几个色谱条件都确定下来了就可以基本认为这个方法已经开发成功，所以开发方法时我们可以通过逐一的考查这几个色谱条件来进行。


考查色谱条件是需要通过在色谱仪上进样来进行的，我们先要了解被分析物，要了解它的物理、化学性质，特别是化学结构式非常关键。色谱方法开发工作步骤如下：


1.收集资料


对它的分子量、结构式，以及在水、甲醇、乙腈、四氢呋喃、正己烷和异丙醇中的溶解度有一个初步的了解。对分子量的了解在选择色谱柱的过程中是非常重要的，因为色谱柱填料的孔径对化合物的分离具有重要的影响。

填料孔径对分离度和峰形是有一定影响，120 Å的色谱柱通常适用的范围为分子量<10000的，如果分子量太大，在填料为120 Å孔径的柱子上分离度会比较差，因为样品分子在色谱柱上有较好的保留是由于可以进入到填料的微孔里面，与键合在表面上的C18长链相互作用，通常孔径直径需要大于分子直径的3倍以上才不会对分析造成影响。因此一般分子量10000以下的化合物建议用120 Å的柱子来分析，分子量大于1W小于20W的用300 Å的来分析，分子量大于20W的就要用凝胶柱了。

结构式对于分子极性大小的预测以及后续调整峰形时具有非常重要的作用，如－COOH、－NH2、－NHR、－NR2、－OH等都是极性基团，而苯环、己环、－CH＝、－CH2－CH3等都是非极性基团，根据经验大致对其极性做一下判断，估计一下可能在C18上（用得最多，我们最熟悉）的保留性能如何，再结合目标化合物在上述所说的几种溶剂中的溶解度状况，对方法开发时可能用正相柱还是反相柱来作一个粗略的判断，以及方法开发完成后的认证有作用。


2.选择色谱柱


I）填料孔径的选择：根据所查资料获得的化合物分子量信息来确认色谱柱填料的孔径；

II）填料键合相（键合相是指C18、C8、苯基柱等）的选择：在没能查到做过该样品的相关资料之前，或者并不了解其极性之前，通常最好选择C18柱作为初始的色谱条件。因为C18柱是我们用得最多的，也是对其色谱保留性能最了解和熟悉的，在C18柱上获得的信息我们可以预测其极性，以及为解决遇到的问题下一步可能将采取的措施。

III）填料粒径、色谱柱型号的选择：在没有特别指明之前，最好使用我们常用的5 μm、4.6×150 mm或250 mm，和前面首选C18作初始条件一样，是为了方便预测其保留性能。


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△液相色谱柱—纳谱分析


3.检测器和波长的选择
目前使用最为普遍的是UV检测器，因此，在不了解其是否有紫外吸收的情况下，我们先要了解其这一性能，用标准品配成合适的溶液进行紫外扫描，收集目标化合物最大吸收波长的数据，确定波长；或者是在有DAD检测器的条件下进几针标准品溶液，通过DAD的三维谱图可以获得化合物最大吸收波长的相关信息。

如无紫外吸收，则需选用合适的检测器。因为检测器是我们监测化合物是否出峰的工具，是我们的能看到化合物的“眼睛”，也是我们开发方法的基础，因此非常重要，需认真选择。


4.流动相的选择

流动相的选择需要根据检测方式来确定，这里以UV检测器为例。液相的流动相最常用的体系有两种，一种是甲醇和水的体系，一种是乙腈和水的体系。

这两种流动相体系没有太大的差异，主要区别在于：
a. 甲醇价格比乙腈便宜很多；
b. 乙腈的洗脱能力比甲醇强；
c. 甲醇在紫外上的吸收截止波长在210 nm左右，也就是说在210 nm以下基线的本底会比较高，与乙腈相比会大大降低化合物的峰高，削弱目标化合物的检测灵敏度；
乙腈的吸收截止波长在190 nm左右；如果确定的波长在210 nm以下，则应该选择乙腈和水作为流动相体系，如果远离这个波长的地方，则甲醇应该是首选。


5.流速的选择

与上述所确定的色谱柱型号相对应的流速，4.6 mm内径色谱柱选1 mL/min；


6.温度的选择

如化合物对温度没有特别的需求（如温度高了不稳定等），则在方法开发之初，尽量使用室温，这样开发出来的方法普适性会比较广一些。升高温度往往在后面为了提高目标化合物与其它杂质的分离度时使用的，或者为了降低柱压等，在进一步优化色谱条件时才去考虑。

综合以上所选择的一些条件作为初始条件，就可以开始下一步的目标——“找到目标化合物峰”。要找到目标化合物的峰，首先就要在我们最熟悉的C18柱上面测试一下，了解化合物的保留能力和大致的极性。


具体的步骤是：先用纯甲醇做流动相，看化合物是否被洗脱下来，如果被洗脱下来峰高是多少，收集这些数据；


然后流动相中甲醇的比例以10％的速度递减，即甲醇：水＝90:10、80:20、70:30......纯水，看流动相从最初的100％甲醇——100％水的过程中每变动10％的比例，谱图上会多些什么峰，峰高会不会发生变化，多出来的峰是从哪里来的；


这个过程会有三种结果：

1）纯甲醇条件下没能洗脱下来，这样说明化合物的极性很弱，保留能力非常强，应该可以考虑用正相体系来做，如选择硅胶柱；

2）纯水条件下很难出峰而纯甲醇时很快洗脱下来，这意味着我们可以通过调整流动相的比例找到这个峰，并结合前面流动相比例10％变化的系列数据，选择合适的流动相。

3）纯水条件下也仍然很快就出峰，这说明化合物的极性很强，此时需要结合分子的结构式来判断，有可能是哪些基团导致了样品这么快的出峰，然后采取相应的对策，考虑添加缓冲盐，调节pH，如果需要的话，甚至考虑添加离子对试剂。


通常带有－NH2、－NHR、－NR2等基团的时候添加含－SO3－磺酸基的离子对试剂（如辛烷磺酸钠）以增强保留，而带有－SO3－、－PO4－等极性基团的化合物，则需添加如四丁基溴化铵、四丁基氢氧化铵等含N＋R4的离子对试剂。

二. 调整峰形

通过调整流动相中的酸或碱或缓冲盐的pH来实现对峰形的调节。

三. 进一步完善方法

主要是解决样品中的问题，如保留时间、目标化合物与杂质的分离度等。


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