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乳铁蛋白是一种具有多种生理活性的天然蛋白质,参与调节免疫功能、抗微生物、调节铁吸收、促进肠道细胞增殖分化等多种生理过程。
今年8月开始实施的《GB 5009.299-2024食品安全国家标准 食品中乳铁蛋白的测定》中规定了食品中乳铁蛋白的提取与检测方法,纳谱分析紧跟新国标要求,曾在今年3月份推出第一代SelectCore Heparin肝素亲和柱(货号:HEP065-030001-1)。考虑到乳制品过柱速度慢,纳谱分析近期推出第二代的SelectCore Heparin肝素亲和柱(货号:HEP065-030001-2),相比第一代产品,第二代的肝素亲和柱滴速更快(快30%左右),载量更高(高90%左右),适用于多种固态乳粉和液态奶。另外,针对多个客户反馈国标提取液提取效率不高,需要2~3次才能充分提取,前处理时间较长的情况,纳谱分析开发了一种可以提高提取效率的试剂乳铁蛋白结合液A,进行一次提取就可以达到之前三次提取的效果,我们经过多种固态乳粉和液态奶的测试,与标示量数据都较为接近,可以大大加快乳铁蛋白项目的前处理时间。
适用范围
本方法适用于巴氏杀菌乳、调制乳、含乳饮料、调制乳粉及乳基婴幼儿配方食品中牛乳铁蛋白含量的测定。 一、实验步骤 试剂配制 磷酸盐缓冲液Ⅰ:称取7.1 g磷酸氢二钠、58.4 g氯化钠,加900 mL水溶解,用磷酸调pH至8.0±0.2,加水定容至1000 mL,临用现配。 磷酸盐缓冲液Ⅱ:称取28.4 g磷酸氢二钠,加800 mL水溶解,用磷酸调节pH至7.5±0.2,再加入20 mL乳铁蛋白结合液A,加水稀释至1000 mL。 0.1%三氟乙酸溶液:量取1 mL三氟乙酸注入900 mL水中,用水稀释至1000 mL,过0.45 μm滤膜。 样品的制备 2.1 液态试样(巴氏杀菌乳、调制乳、含乳饮料) 称取5 g(精确至0.01 g)试样,置于25 mL容量瓶中,加入10 mL磷酸盐缓冲液Ⅱ,涡旋30 s,用磷酸盐缓冲液Ⅱ定容至刻度,在4 ℃条件下10000 r/min离心15 min,吸取中间层澄清溶液20 mL至50 mL容量瓶中,再次在4 ℃条件下10000 r/min离心15 min,吸取中间层液体待净化。 2.2 固态试样(调制乳粉、乳基婴幼儿配方食品) 称取1 g(精确至0.01 g)试样,置于50 mL容量瓶中,加入20 mL温热(温度不超过45 ℃)的磷酸盐缓冲液Ⅱ,涡旋30 s,冷却至室温,用磷酸盐缓冲液Ⅱ定容至刻度,在4 ℃条件下10000 r/min离心15 min,吸取中间澄清层溶液30 mL至50 mL离心管中,再次在4 ℃条件下10000 r/min离心15 min,吸取中间层液体待净化。 固相萃取法 SelectCore Heparin肝素亲和柱1mL; 活化:肝素亲和柱使用前先加入5.0 mL磷酸盐缓冲液Ⅱ活化; 上样:准确移取10.0 mL上述样液过柱,控制流速在1 mL/min~3 mL/min; 淋洗:待样液滴完后,用10.0 mL磷酸盐缓冲液Ⅱ淋洗,弃去流出液; 洗脱:用4.8 mL磷酸盐缓冲液Ⅰ分两次洗脱,收集洗脱液并用磷酸盐缓冲液Ⅰ定容至5.0 mL,供上机检测分析用。 注:在样品过柱前,可根据实际样品中乳铁蛋白含量调整具体上样液体积(纳谱分析SelectCore Heparin肝素亲和柱(货号:HEP065-030001-2)柱容量是10 mg)。 液相色谱仪器条件 Column: ChromCore 300 C4-T,5 μm Dimension: 4.6×250 mm Mobile Phase: A)0.1%三氟乙酸溶液 B)乙腈 Gradient: t(min) A B 0 85 15 20 15 85 22 85 15 25 85 15 Flow rate: 1.0 mL/min Temperature: 30 °C Injection: 50 μL Detection: UV 280 nm 二、实验谱图及结果 实验谱图
由色谱图和加标回收率数据可以看出,纳谱的乳铁蛋白结合液A能够提高磷酸盐缓冲液Ⅱ的提取效率,只需提取一次即可,缩短了提取时间,并且加标回收率也符合国标要求。
Tips:
(1)乳铁蛋白结合液A放置时间过长可能会出现沉淀,使用前摇匀即可;
(2)配制磷酸盐缓冲液Ⅱ时,调pH前的溶液pH值应在9.00以上,否则提取效率会降低。调完pH后加乳铁蛋白结合液A然后定容,定容后混匀即可,不需要剧烈搅拌;
(3)如不想使用乳铁蛋白结合液A,样品提取的次数需要增加,特别是配方奶粉,定容体积不变的情况下需进行少量多次提取才能提取比较充分;
(4)纳谱分析的SelectCore Heparin肝素亲和柱采用的是可穿透的上盖,如果需要加体积较大的溶液,可以直接在小柱上面加一个12 mL的SPE上样柱或20 mL注射器即可;如果希望在更大体积的亲和柱上一次性把10 mL提取液全部加上去,可以选择SelectCore Heparin RC肝素亲和柱(该产品是为大体积上样用,填料类型和规格不变),如图3所示;
(5)固相萃取过程中的上样步骤,如果滴速过慢可适当加压,流速控制在1 mL/min~3 mL/min即可;
(6)固相萃取过程中的洗脱步骤需要用4.8 mL磷酸盐缓冲液Ⅰ分两次洗脱;
(7)实验观察到部分聚醚砜材质的滤器对乳铁蛋白会有大概10%左右的吸附,目前测试下来,经过Heparin固相萃取柱净化后的溶液较为澄清,可以不过膜进样;
(8)首次使用ChromCore 300 C4-T色谱柱时,可能会出现色谱峰型不对称或响应低的情况,此时需要使用高浓度牛乳铁蛋白对照品(400 μg/mL进样100 μL)对色谱柱进行钝化处理,钝化后将色谱柱冲洗至无牛乳铁蛋白的目标峰后,再进行样品分析; (9)因为蛋白在C4分析柱上会有一定残留,建议在做柱容量测试后,空针进样两次把蛋白残留降低后再进行后续测试; (10)ChromCore 300 C4-T色谱柱使用结束后,需用纯乙腈冲洗30 min对色谱柱进行保存,保证下次色谱柱可以正常使用。