背景

酸性磷酸酯酶：活力10.4 unit/mg。

酸性磷酸酯酶溶液：取适量酸性磷酸酯酶，用水稀释至0.04 unit/mL的酶解液。

三氯乙酸溶液(20 g/L pH 4.8)：称取20 g三氯乙酸，加水约950 mL使其溶解，用氨水调pH至4.8（±0.1），再加水定容至1000 mL。

乙酸铵缓冲溶液(2.0 mol/L pH 4.8)：称取乙酸铵77.0 g，加水约450 mL使其溶解，用乙酸调pH至4.8（±0.1），再加水定容至500 mL。

乙酸铵缓冲溶液(0.25 mol/L pH 8.5)：称取乙酸铵9.06 g，加水约450 mL使其溶解，用氨水调pH至8.5（±0.1），再加水定容至500 mL。

10%乙腈-乙酸铵缓冲溶液：量取10 mL乙腈与90 mL乙酸铵缓冲溶液(0.25 mol/L pH 8.5)充分混合均匀。

洗脱液：甲酸-水-甲醇(体积比2：8：90)，准确量取2 mL甲酸和8 mL水加入90 mL的甲醇中，混合均匀。

2.1 提取

称取5 g（精确至0.01 g）试样，置于50 mL具螺旋盖的聚丙烯离心管中，添加250 μL利巴韦林-¹³C₅内标标准工作溶液，加入12 mL三氯乙酸溶液(20 g/L pH 4.8)，和2.5 mL乙腈，振荡提取10 min，6000 rpm离心2 min，取出上清液，下层残渣再加入10 mL三氯乙酸溶液(20 g/L pH 4.8)，重复提取一次，合并两次提取液，并定容至25 mL。

2.2 酶解

准确移取5 mL提取液，加入1.0 mL乙酸铵(2.0 mol/L pH 4.8)，再加入100 μL酸性磷酸酯酶溶液，加盖后涡旋混合1 min，于恒温烘箱中37 ℃培养2 h。取出后冷却至室温，用氨水调节pH至8.5（±0.1），混匀，6000 rpm离心2 min，取上清液备用。

• 活化：SelectCore PBA固相萃取柱100mg/3mL，依次加入3 mL乙腈、3 mL乙腈-1%甲酸水（体积比，3:1）、3 mL乙酸铵缓冲溶液(0.25 mol/L pH 8.5)活化，并保持柱体湿润；

• 上样：加入2.2中全部上清液，弃去流出液；

• 淋洗：依次用5 mL 10%乙腈-乙酸铵缓冲溶液、2 mL 5%氨水甲醇淋洗，弃去流出液，真空抽干5 min；

• 洗脱：加入4 mL洗脱液，收集全部洗脱液至玻璃管中，于50 ℃下氮气至干。准确加入1.0 mL 0.1%甲酸水-甲醇（体积比95：5）溶解残渣，过0.22 μm有机滤膜，供液相色谱-质谱仪测定。

Column：            ChromCore AQ C18，3 μm

Dimension：        3.0×100 mm

Mobile Phase：   A）0.2%甲酸水

                           B）乙腈

Gradient：          t(min)      A            B

                           0            100          0

                           2.2         100          0

                           3.0          95           5

                           4.0          10          90

                           5.0          10          90

                           5.5          100         0

                           10           100         0

Flow rate：         0.4 mL/min

Temperature：    35 °C

Injection：          2 μL

离子源：电喷雾离子源（Electrospray ionization，ESI）正离子模式

监测方式：多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）

电离模式：ESI

Curtain Gas：40.0 psi

Collision Gas：6 psi

Ion Spray Voltage：5500.0 V

Temperature：500.0 ℃

Ion Source Gas1：50.0 psi

Ion Source Gas2：50.0 psi

Entrance Potential：10.0

Collision Cell Exit Potential：12.0

样品中的利巴韦林代谢物经酸性磷酸酯酶水解为利巴韦林原药，采用三氯乙酸-乙腈溶液对利巴韦林进行提取，经SelectCore PBA固相萃取柱净化、洗脱液氮气吹干，复溶过滤后上液相色谱/串联质谱仪测定，该方法简便、快速、干扰少，是一种理想的检测方法。同时，本文优化了样品复溶时的溶剂体系，由国标方法中乙腈-水（体积比90：10）优化为0.1%甲酸水-甲醇（体积比95：5），优化后的溶剂体系可极大降低溶剂效应的干扰。由实验图谱和加标回收率数据可得，选择纳谱分析的SelectCore PBA固相萃取柱（100mg/3mL）和ChromCore AQ C18 3μm, 3.0×100mm液相色谱柱，不同加标量的两组实验回收率均高于85%，且目标物质出峰时间快，峰形好，符合国标检测要求。