本文将提出了一些切实可行的恢复方案供大家讨论或参考。着重点在最常用的键合硅胶柱上，其它类型的反相柱的清洁和再生步骤最后也有介绍。

通常，样品基体中会含有一些对分析者来说不感兴趣的东西，如盐、脂类、含脂物质、腐殖酸、疏水蛋白质和其它一些生物质，是一些可能与HPLC柱发生相互作用的物质。

这些物质和目标分析物比，保留能力有些强，有些弱。那些保留能力小的杂质，如盐类，通常在死体积处就会被洗脱出来，在谱图上表现为干扰峰、小斑点、基线扰动、甚至是倒峰等等。

而样品基体中的强保留物质，如果流动相的洗脱能力从来没有调高到足以把它们洗脱出来，多次上样后，它们就会在柱头累积。这种现象通常在等度洗脱时容易观察到。

保留能力中等的杂质能被缓慢洗出而且表现为 宽峰、基线扰动或者基线漂移。
有时，这些被吸附的杂质累积到杂质本身足以作为一种新固定相的程度。分析物能与这些杂质作用，起一定的分离作用。此时保留时间会发生漂移，并出现峰形拖尾。

如果污染程度再严重下去，柱子的反压能超过泵所能承受的最大压力，依照发生堵塞的位置不同，可使柱子无法工作或使柱头塌陷产生空洞。

• 对于反相柱子，不建议用表面活性剂如十二烷基磺酸钠（SDS）和Trition，因为这些化合物必然会牢固吸附在硅胶键合相柱子上，很难除去。用表面活性剂会影响改变填料表面性质。然而，Separation Group的研究表明:多肽合成产生的保护基和清除剂对柱子的污染，可以通过在流动相中加入500μL 1％SDS溶液以1ml/min的流速清洗掉。然后再用从5％～95％乙腈/1％（v/v）三氟醋酸的梯度洗脱，在起始条件平衡后，就可以恢复柱子的多肽分离功能。

去除金属离子吸附          

有时用有机溶剂清洗污染柱子并不能成功，尤其是有金属离子吸附在硅胶或键合相上时：

• 可用鳌合剂如0.05M乙二胺四乙酸（EDTA）冲洗色谱柱，EDTA能与许多金属离子络合并溶解它们。

• 用完EDTA溶液后，一定要用水充分冲洗柱子。

• 如果样品中含离子化合物，改变pH可以使它们转为非离子状态，这样就可以被水/有机溶剂洗脱下来。例如，强碱性杂质能在pH低于3时被除去，在这个条件下质子铵变得水溶性更好。酸性杂质能在pH调整到大于其pKa时被洗下来--大约时pH8或9，此时酸性杂质处于离子状态。然而，要注意硅胶柱子在长时间处于高pH条件下容易被破坏。

避免柱子长菌

• 要避免缓冲液或用缓冲液保存的柱子长菌，可以用普通家用漂白剂1：10或1：20稀释后来冲洗，50柱体积冲洗后，接着至少要用50柱体积色谱纯的水冲洗。

• 不能让漂白水通过检测器，因为漂白水会腐蚀检测池。

• 避免溶剂瓶中缓冲液长菌，每次只取足够的缓冲液用，把没用的保存在冰箱里，添加0.1％叠氮化钠在缓冲液中，不能让不流动的缓冲液在柱子中长期存在。

关于使用离子对试剂

色谱工作者经常会讨论到离子对色谱中离子对试剂对固定相的影响。显然离子对试剂如辛烷－磺酸（用于阳离子）和四烷基铵溴（用于阴离子）在一定浓度的有机修饰剂下能很强地吸附在硅胶键合柱子上，柱子因此被污染且很难回复到起始状态。

• 因此，一般认为用过离子对试剂的柱子都应该专用，而不能再当常规的反相色谱柱用。

• Bidlingmeyer不同意这种观点，他认为：离子对色谱所用的pH酸度或碱度很大，在酸性条件下（pH1-3）使键合相和封尾试剂水解，在高pH条件下（pH7-8）溶解硅胶基质，因而使一些柱子的性能改变。要清除磺酸离子对试剂，他建议首先用原先的流动相（仅少了离子对试剂）至少冲洗20柱体积，然后用无缓冲液的流动相冲洗(在这个清洗步骤中，甲醇可能比乙晴更有效；如果是长链的离子对试剂，则用四氢呋喃)。很明显，磺酸离子对试剂和铵离子对试剂有着不同的表现。

• Bidlingmeyer和他的合作者证明了：在C18柱子上用甲醇比例超过70%的流动相，长链离子对试剂，如SDS不会吸附在固定相上。这个发现跟Separation Group的结果一致。

整体柱的清洗方法

 硅胶键合整体柱如Chromolith 柱子（德国默克公司产品），清洗时可跟别的硅胶柱一样处理。

用来分离生物分子的聚合柱也会被污染，也需要清洁。

• 聚合材料非常之好的化学稳定性通常是这种柱子的强处所在。很多厂家建议用1.0M的硝酸或1.0M的氢氧化钠来清洗聚合物柱。一些反相聚合柱，如用聚苯乙烯/二乙烯基苯（PS－DVB）微球作填料的柱子，和用CIM RP－SDVB片做的聚合物整体柱，以及Swift柱子（美国Isco公司），都能耐宽的pH范围（通常pH11～13或有时pH0～14）。

• 使用者用强有机溶剂冲洗柱子时要注意聚合物材料的溶胀和收缩问题，其程度一般由其交联度决定。高于8～10％交联度的聚合物通常有较好的机械性能，在水溶液中收缩很少，在有机溶剂中膨胀也不大。用一系列溶剂清洗聚合柱之前，最好能阅读使用说明书或咨询生产商的技术支持部门。

BIA Separation建议

PS-DVB柱再生办法

• 清洗含丁基和乙基的丙烯酸甲酯为基质的整体柱，可按顺序分别反向冲洗10个柱体积的1.0M氢氧化钠、水、20％乙醇溶液和工作缓冲液来清除沉淀的蛋白质。

• 如果有疏水性更强的蛋白质存在，就应该在水清洗之后插入一个30％异丙醇或70％乙醇的清洗步骤。

• 如果要清洗或灭活微生物菌落，PS－DVB聚合整体柱可以用0.5～1.0M的氢氧化钠彻底清洗，在室温下至少要用氢氧化钠洗泡一个小时。

• 用传统聚合基质装填的柱子，用来分离一些溶解度很小的蛋白质如膜蛋白、结构蛋白、和病毒外壳蛋白等，需要用较强的清洗条件。例如含3M盐酸胍的50％异丙醇溶液在60℃才能把这些蛋白质除去。

• 在固相树脂中去除合成肽，能产生有反应活性的有机正离子，可被苯甲醚和苯硫基甲烷清除。

• 清除正离子反应产生了大的芳香族分子，这些芳香族分子会在肽纯化时污染柱子。这种污染物在C18柱子上有非常高的保留没法被100％的甲醇或乙晴洗出。要清洗这类柱子，必须把柱子反向冲洗，依次用5柱体积100％异丙醇，3-5个柱体积二氯甲烷，然后再用3-5柱体积异丙醇，最后到初始溶剂系统。可以通过260nm紫外检测到有芳香族杂质的洗脱出。

ZirChrom Separations，Inc.（Anoka，Minnesota，USA）生产了一系列的氧化锆基质柱子。该产品系列有几种反相柱子，包括聚丁乙烯，聚苯乙烯和石墨化碳等。

氧化锆比硅胶柱子的pH耐受性要好，所以涂上氧化锆能够耐受更苛刻的条件如高pH和高的操作温度。然而，因为其特殊表面性质，需要维持一定的实验条件才能用这种柱子成功分析各种分析物。

• 羧酸，氟化物和磷酸根离子都在氧化锆柱子上有强吸附。要清除这些物质，应该用20％乙晴－0.1M氢氧化钠或0.1M四甲基氢氧化铵混合物冲洗50个柱体积，然后用10柱体积的水、50柱体积20％乙晴－0.1M硝酸混合物、10柱体积水，最后是用20柱体积100％有机溶剂，依次冲洗。

• 对于聚丁乙烯和聚苯乙烯柱子，可以用甲醇、乙晴、异丙醇或四氢呋喃清洗。

• 而石墨化碳柱子至少要用20％四氢呋喃的溶剂。