Q1. 流动相对峰高和峰面积有哪些影响？

问题描述：

检测二氯喹啉酸残留，色谱条件：流动相为乙腈：水（V/V）=1:1，水用磷酸调到pH=4；流速1mL/min；波长225nm；进样量20μL。此条件下，标样出峰时间较早，保留时间4min左右，样品峰分不开。调整了流动相比例，乙腈：水（V/V）=1:3，保留时间15min左右，但峰高和峰面积明显降低，且浓度较低时不出峰，怎样解决？

解答：

（1）二氯喹啉酸属于弱酸性化合物，在水中的溶解度为0.065mg/L，在甲醇中溶解性比乙腈要好（难溶于乙腈），问题产生的原因可能是目标物在乙腈中溶解度低，可以考虑改用甲醇和水作为流动相。
（2）二氯喹啉酸的pKa值为4.35，对于弱酸性物质一般流动相pH值的选用原则是最好小于等于其pKa值两个单位，以保证待测物99%以上呈分子状态，否则容易产生峰拖尾、峰分叉等现象。而原水相部分pH=4，和二氯喹啉酸pKa值很接近，该条件下，二氯喹啉酸处于分子、离子形态各占一半的混合状态，不利于二氯喹啉酸在色谱柱上的保留，可能会影响目标物峰型。兼顾目标物pKa值和色谱柱pH耐受范围，建议将流动相pH调节至2~3来优化实验。

Q2. 峰面积差异很大，忽高忽低，这是为什么?

问题描述：

使用液相色谱，将一个样品连进六针，峰面积差异很大，忽高忽低，这是为什么?

解答：

1、进样器有的时候会出现气泡，如果此时连续进一个样品就会出现峰面积忽高忽低，多做几次purge injector就OK了。

2、用标准品试一下看是不是样品的问题;然后再看看柱压柱温、流速、进样器、氘灯有没有问题。

3、查看定量环是否有气泡

4、进样的六通阀、色谱柱接口、泵至色谱柱接口的管路中是否有泄漏现象

其实，说到底一般是两种情况，要么是样品的原因，要么是仪器原因。如果是样品，建议换一下其他物质试一下;如果是仪器原因，可能是进样器、定量环、比例阀等等问题。

Q3. 新柱怎样进行活化及维护？为什么要这样做？ 

问题描述：

对于一根常用的C18柱，拿到一根新柱的时候应该怎样进行活化及维护？为什么要这样做？

解答：

新柱活化，实际上是一个平衡的过程，除了用流动相平衡外，有时候还必须用所测样品对新柱进行平衡，特别是测定分子量比较高的多肽，尤其重要。因为分子量高的物质分子，扩散速度慢，平衡所需时间也相应较长。具体平衡方式也很简单，多进几次样品，直到峰面积和保留时间稳定，再进行正式进样测定。

如果要加快平衡时间，把前面用来平衡的进样样品浓度加大，或者不等洗脱完成，连续进样多针。用待测物对新柱平衡，目的是将硅胶基质填料表面具有非特异性吸附的位点的吸附能力饱和掉。

Q4. 不同进样瓶出峰不一致？

问题描述：

用高效液相色谱法检测饲料中三聚氰胺，同一个样品分装两个进样瓶，为什么一个进样瓶中检出三聚氰胺，另一个进样瓶中没有检出？

解答：

（1）同一个样品的两个进样瓶，需要区分一下进样瓶中装的是哪种溶液，大致可分为以下3种：
a.两个进样瓶中装的都是三聚氰胺的标准溶液；
b.两个进样瓶中装的实际样品加标处理后进样液；
c.两个进样瓶中装的是未知浓度实际样品处理后的进样液。
（2）如果是情况a，建议将同一个进样瓶重复进样5次以上，检查仪器或者分析方法的重复性。色谱柱未平衡好，容易出现前几针不出峰或者保留时间漂移严重，随着进样次数的增加，仪器及色谱柱趋于平衡，后面再进样时出峰正常。
（3）如果是情况b，除了考虑上述原因之外，还要考虑样品前处理的因素。样品前处理过程中，三聚氰胺未提取出来或者损失掉，也可能出现同一个样品，不一样的检测结果。
（4）如果是情况c，还需要考虑的是杂质组分干扰，可能在某种情况下刚好在三聚氰胺的保留时间出有杂质峰，将杂质峰误判为三聚氰胺，而在进下一针的杂质峰保留时间出现漂移，导致两次测定的结果不一致。

Q5. 预柱或保护柱该不该用?

问题描述：

原来分析中药品种时，我一直都是用保护柱。但来到新公司后，发现大家都没有使用，几个实验室连保护柱都没找到一个，也就是说大家从来都没有用过。后来问一个老员工，说是有可能影响药品分析。我就想问：安装保护柱后会影响样品分析吗？我们做的大多是头孢类的抗生素。

解答：

应该这样说，加上保护柱，肯定有利于保护色谱柱不受一些颗粒物质的堵塞，肯定有害于分离度和柱效，因为保护柱中间有着死体积的存在。但是如果保护柱接得好，并且尽量控制其匹配性和经常更换，分离度和柱效应该影响并不大。

头孢类的抗生素也要看到底是原料药还是制剂喽，有些原料药，可以根据色谱柱的损耗选择添加预柱(中间是个筛板)，制剂的话，如果有辅料严重干扰或者流动相盐分比较大，那还是最好配个保护柱。

Q6. 为什么HPLC用缓冲盐时要加在线Seal-wash？

解答：HPLC用缓冲盐时，由于泵头内的缓冲盐溶液存在盐析现象，析出的细小盐粒非常坚硬，它附着在柱塞杆上，柱塞杆往复运动时，容易产生划痕，并磨损密封垫，造成漏液等故障现象。在线Seal-wash选项能有效的带走可能存在的缓冲盐结晶。

缓冲盐的浓度在0.1M或大于0.1M时，必须使用该在线冲洗选项。

清洗液配制:  90%水+10%异丙醇。该混合液可抑制菌类生长和减小水的表面张力，不能干涸。

Q7. 如何防止溶剂过滤器的堵塞，以及堵塞后的处理？

解答：

溶剂的质量或污染以及藻类的生长会堵塞溶剂过滤器，从而影响泵的运行，尤其水溶液或磷酸盐缓冲液（PH = 4-7）。以下几种方法可以有效防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞。

1、请严格执行溶剂过滤。

2、请勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液。

3、如果应用许可，可在溶剂中加入5%甲醇。

4、在溶剂瓶内溶剂的上方小流量连续吹惰性气体如氮气，以隔绝空气。

5、避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下，尽量使用棕色的溶剂瓶装水溶液或磷酸盐缓冲液。

Q8. 如何选择合适的泵头活塞密封圈？

解答：泵头活塞的标准密封圈能适合于大多数应用，但使用正相溶剂（如正己烷），不适合使用标准活塞密封圈，特别是长时间使用时，需更换另一种不同的密封圈，我们建议使用聚四氟乙烯密封圈。

注意：聚四氟乙烯密封圈的压力范围为：0—200bar；建议在泵的压力限制中，将最大压力设为200bar。

Q9. 使用梯度比例时要注意哪些事项？

解答：当盐溶液与有机溶剂溶液混合时，盐溶液能与有机溶剂溶液完全混溶，而不会出现沉淀。但是在比例阀的混合点，重力作用使盐颗粒沉淀下来，通常，下面的阀接水相/盐溶液，上面的阀接有机溶剂，此法连接可有效使盐回落到盐溶液中，并被溶解。若颠倒过来，盐可能落在有机溶剂中，出现问题。

强烈建议：当使用缓冲盐溶液和有机溶剂时，推荐将缓冲盐通道接在下面通道上，有机溶剂通道直接接在上方通道上；定期用水冲洗所有的通道，以除去阀口上可能出现的盐沉淀。

Q10. 溶剂应该如何保存？

解答：

棕色玻璃瓶会避免藻类的生长。

经常过滤溶剂以免其中微粒永久性阻塞毛细管。

避免使用下述可腐蚀钢铁的溶剂：

1、碱金属卤化物及其酸溶液(如：碘化锂、氯化钾等)。

2、高浓度无机酸，如硝酸、硫酸。

3、可能含有过氧化物的色谱醇醚(如THF、二氧六环、二丙基乙醚)。这些在使用前必须用干燥氧化铝过滤除去过氧化物。

4、含强络合剂的溶液(如EDTA，乙二胺四乙酸)。

5、四氯化碳与2-异丙醇或四氢呋喃的混合液。

Q11. 如何正确选择待测物质紫外吸收波长？

问题描述：

见图5-22，该化合物应该选择什么检测波长？是否尽可能取210nm、220nm这样的整数波长？另外254nm的波长为什么很常见？

解答：

（1）选什么波长看你的检测目的和对灵敏度的要求，同时还有兼顾杂质等其他物质的吸收波长，以及流动相的紫外吸收截止波长。一般选择的是最大吸收波长，如果最大吸收波长有干扰，就选次波长，要综合考虑目标物响应和基线。
（2）从图5-22可以看出，目标物紫外最大吸收波长为216nm，但是考虑到216nm接近不少有机相的紫外吸收截止波长，所以可能造成梯度洗脱时基线波动较大，噪声比较高，相同浓度条件下待测物信噪比不一定比次吸收波长261nm处高，而336nm处目标物紫外吸收波长较261nm处低很多，灵敏度较低，综合考虑建议采用261nm的波长作为最佳选择。
（3）254nm对常见的共轭结构和羰基官能团都有吸收，对饱和基团也有弱的吸收，而对反相色谱常用的甲醇、乙腈的透过率很高，一般作为通用波长使用。
（4）关于问题里面提出的波长选择是否尽可能取整数？目前应该没有这种要求。

Q12. 峰面积重现性不好？

解答：

观察压力是否稳定，以及观察峰面积变化是否有规律。

1、若压力不稳定，请检查造成压力不稳定的因素，如：漏液，排液时间不足够，盐浓度过高导致盐析，主动阀比例阀内漏，等。

2、若压力稳定但峰面积呈无规律变化，请检查样品是否足够，确认样品的稳定性，必要时重新配制。检查进样阀是否漏液。等。

3、若压力稳定且峰面积呈规律变化，多数为色谱柱未平衡好。

Q13. 怎样提高高效液相色谱法的柱效？

解答：
1.要想提高液相色谱法的柱效，应当用小而均匀的固定相颗粒填充均匀，以减小涡流扩散和流动相传质阻力，这是最佳的提升柱效的方法。比如使用纳谱分析色谱柱，其基于苏州纳微科技股份有限公司自主研发的国际领先且具有创新性的UniSil® 和UniCore®单分散硅胶/聚合物微球，具有极窄的粒径分布。

2.改进固定相的结构，可以减小滞留流动相传质阻力以及固定相传质阻力。
3.选用低粘度的流动相(如甲醇、乙腈等)，也有利于减小传质阻力，提高柱效。
4.合适的柱温，也会影响到柱效。
5.降低流速、增加柱长也可以提高柱效。

Q14. 三乙胺对保留时间的影响？

问题描述：

四烷基季铵盐（如四丁基硫酸氢铵、四丁基溴化铵、四丁基氢氧化铵等）在水中电离后，也形成了类似N＋H(CH2CH3)3的结构N＋(CH2CH2CH2CH3)4 ，这种结构也能有效的与Si－O－产生较强的静电作用，此类离子对用的比较少，但它的作用仅是掩藏Si－O－吗，它对物质的保留性能有何影响，实验中发现检测胺化物时，流动相中加入磷酸缓冲盐有增加物质保留的趋势，而加入三乙胺则会降低物质的保留能力？

解答：

四丁基氢氧化铵等离子对试剂确实不如辛磺酸钠等极性基阴离子的离子对试剂用得普遍，原因是酸类极性物质很容易通过降低pH值的方法提高在反相色谱中的保留能力，降低pH可抑制酸的电离，使酸处于中性状态而与疏水碳链的作用力增强。而碱类分析物则受硅胶基质pH上限的严重影响（以前上限是8，后来抬到10，直到最近杂化硅胶才将pH上限提到12左右）。

铵盐类离子对试剂确实有辛磺酸钠等所不具有的屏蔽硅醇基作用，但其主要作用还是疏水端和疏水固定相结合，外露的阳离子亲水端和酸阴离子作用，从而提高其保留能力。当然同样还有第二种解释机理，离子对试剂先和分析物结合，掩藏极性基，从而提高极性分析物在反相色谱中的保留能力。而且丁基比辛基疏水性差，这种情况下，认为后面的结合机理占上风的可能性更大。

检测胺类化合物，加入三乙胺预先和硅醇基结合，胺和硅醇基作用被三乙胺取代，保留下降是肯定的。

Q15. 聚合物基质色谱柱优缺点？

问题描述：

聚苯乙烯-二乙烯苯柱耐高温、耐酸碱、但有关这方面的文献很少，但对于他的分离效能我一直心里没底，我的问题有三：1、分离效果与ODS比较，是相当呢，还是更胜一筹，或是更差？2、我原以为它是整体柱，但看过资料后发现也是颗粒的比如5μm，请问该类型的柱是否符合速率理论、是不是粒径越小分离效果会几何级的增加？3、问什么没有1.7μm的这种柱出现呢？

解答：

聚合物基质色谱柱的优点你已经提到了，它的缺点有：对小分子分离的柱效相对硅胶基质色谱柱要低，表面衍生化修饰也没有在硅胶表面丰富，机械强度低耐压性不好，还有碰到某些有机溶剂会溶胀等。

聚合物基质柱当然也符合速率理论！它柱效低主要是因为分析物在聚合物固定相中的传质速度比在硅胶表面固定相中慢很多。不过粒径越小柱效几何级增加的规律还是有的。1.7μm的硅胶基质填料也是最近几年才商品化，1.7μm的聚合物基质没出来也正常，或许永远都不出来了，因为聚合物耐压差，粒径做这么小，它根本承受不了这个高压吧，但愿以后会有能抗高压的聚合物填料研究出来。

Q16. 保留时间不稳定，原因何在？如何解决？

问题描述：

用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在？如何解决？

解答：

关于漂移问题：1． 温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定2． 流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等3． 柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡关于快速变化问题1． 流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定2． 泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。3． 流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合

Q17. 液相色谱柱封端与不封端对检测结果有哪些影响？

解答：

（1）由于空间位阻效应，较大的硅烷分子不可能与载体表面上较小的硅羟基全部发生反应，因此残余羟基是不可避免的，当使用双或三官能团硅烷化试剂时，还会产生新的硅羟基。这些残余羟基，特别是在反相填料的情况下，对产品的性能影响很大，它可以减小表面的疏水性，对极性化合物，特别是碱性溶质产生二次化学吸附，而残余羟基浓度的变化又是产品性能不重复的重要原因。所以除对键合反应本身进行改进之外，键合反应结束后，一般都要用三甲基氯硅烷或六甲基二硅胺等小分子硅烷进行处理，即封尾（封端），以尽量减少残余硅羟基，这对提高键合相填料的稳定性是很重要的。

（2）另一方面，也有一些C18商品填料是不封尾的，以使其与水系统流动相有更好的“湿润”性能，在一定的条件下可以对分析某些极性化合物的分析提供更好的分离效果。见图5-13，维生素D2、D3在不封端的C18色谱柱上分离效果更好。

Q18. HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法？

解答：

1.样品量不足，解决办法为增加样品量

2.样品未从柱子中流出。可根据样品的化学性质改变流动相或柱子

3.样品与检测器不匹配。根据样品化学性质调整波长或改换检测器

4.检测器衰减太多。调整衰减即可

5.检测器时间常数太大。解决办法为降低时间参数

6.检测器池窗污染。解决办法为清洗池窗

7.检测池中有气泡。解决办法为排气

8.记录仪测压范围不当。调整电压范围即可

9.流动相流量不合适。调整流速即可

10.检测器与记录仪超出校正曲线。解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线

Q19. 做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在？如何解决？

解答：原因可能有：1． 泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理；2． 比例阀失效，更换比例阀即可；3． 泵密封垫损坏，更换密封垫即可；4． 溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法；5． 系统检漏，找出漏点，密封即可；6． 梯度洗脱，这时压力波动是正常的。

Q20. 我购买的HPLC柱验收测试时柱压过高，请问为什么？

解答：柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。

1.拆去保护预柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；

2.把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查；

3.将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，（此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池）。这时，如果柱压仍不下降，再检查；

4.更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系。

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