Q1. 怎么改变流动相比例来延长保留时间?

问题描述：做的黄酮苷，用甲醇:乙腈:四氢呋喃:醋酸(1:1:19.4:78.6)溶液做流动相，现在分离效果不理想，想延长保留时间看看怎么样，也就是增大流动相的极性，给点建议，谢谢！PS：用的C18柱。

解答：用液相色谱，C18柱分离黄酮苷，不是太清楚为什么要选用甲醇+乙腈+四氢呋喃+醋酸这样一种很复杂的流动相体系，难道体积分数78.6%的醋酸是直接用的冰醋酸？这是一种很不可思议的流动相配比。建议直接使用甲醇-水，或是乙腈-水作为流动相，水相中可以适当加点甲酸或是乙酸来得到最佳分离效果。

Q2. 保留时间为什么总在变？

问题描述：苯甲酸的测定中流动相走了很久，进样以后，保留时间还是变，难道这个项目的柱子这么难平衡么？

解答：

保留时间一直在变，说明系统没有平衡好，可以从多个方面去排查原因。

a.流动相可能是最主要的原因，流动相平衡时间是否充足，管路有没有气泡，流动相中有机相是否蒸发，比例阀工作是否正常？

b.泵有可能存在问题，输液是否正常，压力是否稳定，泵密封垫是否完好，是否有漏点？

c.色谱柱也需要排查，是否恒温，是否有漏液？

Q3. 液相色谱中影响峰扩散的有哪些因素？

问题描述：液相色谱中影响峰扩散的有哪些因素？与气相色谱相比，有哪些不同之处？

解答：气相色谱与液相色谱在速率理论方程上的差异主要是由于气体与液体的性质差异造成的。液体的黏度比气体大约100倍，表面张力大约10000倍，密度大约1000倍；气体还具有高压缩性系数。溶质在液体中的扩散系数要远远小于在气体中，液相在传质过程中对理论塔板高度的影响尤其的大。与气相色谱速率理论方程不同的是，液相色谱增加了固定相孔结构内滞留流动相传质项。

因此我们可以得知主要有以下几个方面会影响色谱峰扩张：

1.涡流扩散

涡流扩散是由于柱填料粒径大小不同及填充不均匀等因素造成的流动相在色谱柱内迁移过程中发生的涡流运动。

2.分子扩散

分子是由于进样后，溶质分子在柱内纵轴上存在浓度梯度，引起浓差扩散而使谱带展宽。由于液体流动相的传质速度较慢，分子扩散项B/u可以忽略不计。

3.传质阻力

溶质分子与固定相、流动相分子间存在相互作用，扩散、分配、转移的过程并不是瞬间达到平衡，实际传质速度是有限的，总是存在超前与滞后现象。这使色谱柱总是在非平衡状态下工作，从而产生峰展宽。

4.流速

一般难以观察到最低H对应的最佳流速，因为流速降低，H总是降低。当u>uopt时，H随着u升高而升高，传质引起的色谱峰扩张也会更明显。

5.固定相颗粒大小

涡流扩散项A和流动相传质阻力项Cm均与柱填料粒径dp的平方成正比，所以固定相粒径与色谱峰扩张有很大的关系。

6.柱温

色谱柱温直接影响到分子在固定相和流动相中的扩散系数DS和Dm，从而影响分子扩散和传质的速率。柱温升高，DS和Dm升高，分子扩散导致柱效降低；而传质改善又导致柱效升高；因此柱温对色谱峰扩张的影响是矛盾的。

Q4. 液相色谱使用缓冲盐的注意事项

解答：

1.避免使用盐酸盐，盐酸盐对钢质有腐蚀作用。

2.缓冲液最好要现配现用，往往缓冲液是良好的菌类培养液，隔天或放置长时间实验时会有很多怪现象发生。

3.实验后不可用有机溶剂直接过度，有机溶剂会促使盐类析出，造成液路或色谱柱堵塞，可用95：5的水甲醇冲洗。

4.使用缓冲液要及时掌握pH范围，做到胸中有数。

5.清洗液路和柱子时，有温控可加热到30℃易于冲洗。

6.长时间用缓冲溶液要注意观察接头处有无析出，若有白色盐类析出，可考虑一定周期用10%硝酸冲洗一下液路(拆下柱子，走30mL，再用5倍水冲洗)可以避免液路的堵塞。

7.选择缓冲液要用可靠的试剂，避免不纯的盐类造成不必要的麻烦。

如果流动相中有机溶剂的比例很高是不能用来冲洗缓冲盐的，是洗不出来的。通常C18柱先用5%~10%的甲醇冲洗，是可以把缓冲盐冲洗出来的，然后用纯的有机溶剂来保护柱子。最好的方法是使用与流动相相同浓度不含盐的流动相进行清洗。但就是速度慢一些。用水是为了快速替换，一般在15分钟以内最好，且用0.8的流速较好。如果用纯水冲，容易造成键合的碳链的流失，最好用5%~10%甲醇水溶液冲。可以用纯水代替流动相中的缓冲液，有机相不变。这样冲洗柱子比较稳妥。

Q5. 影响出峰时间的因素有哪些？

问题描述：pH值不同出峰时间不同，具体原理是什么？除了pH值会影响，还有其他因素吗？

解答：

流动相的pH值主要是影响到分配系数而出峰时间的不同。

影响出峰时间的因素有很多，从分配系数、容量因子等各个方面考虑，与目标化合物在固定相和流动相中的分配性质有关，还与流速，压力，柱温等液相色谱仪参数有关，具体涉及下面几种因素的影响：

1.目标化合物本身，具体包括分子量、结构、化合物类型、极性等；

2.流动相，具体包括流动相构成、配比、流动相各组分极性，洗脱方式，流速等；

3.固定相，具体包括固定相种类，结构，色谱柱长度等；

4.分配系数与容量因子，具体包括化合物在流动相与固定相之间的分配情况，柱温等。

Q6. 有没有方法将保留时间提前？

问题描述：我现在用液相色谱做含量测定时，保留时间太长，20分钟左右才出峰，有没什么方法提前，原理是什么？

解答：

可以从通过改变目标组分容量因子k的方式，以及缩短柱长增加柱温等方式，具体可以采取以下方法：

1.调整流动相，具体包括流动相构成、配比、流动相各组分极性，洗脱方式，提高流速等；

2.调整固定相，具体包括固定相种类，结构，缩短色谱柱长度等；

3.增加柱温，降低流动相传质阻力等。

Q7. 流动相使用前为什么要脱气？

解答：

首先我们了解一下不脱气可能造成的影响：

1.气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析（噪声增大，基线不稳，突然跳动）。

2.溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相（如烷基胺）发生反应，降解而改变柱的分离性能。

3.溶解氧能与某些溶剂（如甲醇、四氢呋喃）形成有紫外吸收的络合物，此络合物会提高背景吸收（特别是在260nm以下），并导致检测灵敏度的轻微降低，会在梯度淋洗时造成基线漂移或形成鬼峰（假峰）。

4.若用FLD（荧光检测器），溶解氧在一定条件下还会引起淬灭现象，特别是对芳香烃、脂肪醛、酮等。在某些情况下，荧光响应可降低达95%。

脱气的作用：除去其中溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。排出气泡能减少泵工作的伤害，提高UV检测器的性能高，改善灵敏度。

脱气的方式：加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染，同时需要考虑低沸点溶剂挥发造成的组成变化。

1.抽真空脱气法：易抽走有机相。

2.超声脱气法：流动相放在超声波容器中（一般500mL溶液需超20~30min），此法不影响溶剂组成。超声时应注意避免溶剂瓶与超声槽底部或壁接触，以免玻璃瓶破裂，容器内液面不要高出水面太多。

3.氦气脱气法：在色谱操作前和进行时，将惰性气体喷入溶剂中。严格来说，此方法不能将溶剂脱气，它只是用一种低溶解度的惰性气体（通常是氦）将空气替换出来。主要利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。

4.在线真空脱气法：利用在线脱气机在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。

Q8. 怎样提高高效液相色谱法的柱效？

解答：

1.要想提高液相色谱法的柱效，应当用小而均匀的固定相颗粒填充均匀，以减小涡流扩散和流动相传质阻力，这是最佳的提升柱效的方法。

2.改进固定相的结构，可以减小滞留流动相传质阻力以及固定相传质阻力。

3.选用低粘度的流动相(如甲醇、乙腈等)，也有利于减小传质阻力，提高柱效。

4.合适的柱温，也会影响到柱效。

5.降低流速、增加柱长也可以提高柱效。

Q9. 用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移,有时发生快速变化,原因何在?如何解决?

解答：关于漂移问题

1.温度控制不好,解决方法是采用恒温装置,保持柱温恒定

2.流动相发生変化,解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等

3.柱子未平衡好,需对柱子进行更长时间的平衡

关于快速变化问题

1.流速发生变化,解决办法是重新设定流速,使之保持稳定

2.泵中有气泡,可通过排气等操作将气泡赶出。

3.流动相不合适,解決办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合

Q10. 为何会基线漂移？怎么解决？

解答：

原因

1.柱温波动。(即使是很小的温度变化都会引起基线波动。通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。)

2.流动相不均匀。(流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。)

3.流通池被污染或有气体

4.检测器出口阻塞。(高压造成流通池窗口破裂,产生噪音基线)

5.流动相配比不当或流速变化

6.柱平衡慢,特別是流动相发生变化时

7.流动相污染、变质或由低品质溶剂配成

8.样品中有强保留的物质(高K值)以头峰样被洗脱出,从而表现出一个逐步升高的基线。

9.使用循环溶剂,不提倡。未调整检测器。

10.检测器没有设定在最大吸收波长处。

解决方法

1.控制好柱子和流动相的温度,在检测器之前使用热交换器。

2.使用HPLC级的溶剂,高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气,使用中使用在线脱气或氦气脱气。

3.用甲醇或其他强极性溶剂中洗流通池。如有需要,可以用1N的的酸,(不要用盐酸）。

4.取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册更换流通池窗。

5.更改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。

6.用中等强度的溶剂进行冲洗。更改流动相时,在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。使用离子对试剂、缓冲盐更应注意平衡柱。

7.检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂。

8.改变分析条件。使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中,定期用强溶剂冲洗柱子。

9.重新设定基线。使用新的流动相。

10.将波长调整至最大吸收波长处。重选检测波长。

Q11. HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法

解答：

1.样品量不足,解决方法为増加样品量。

2.样品未从柱子中流出。可根据样品的化学性质改变流动相或柱子。

3.样品与检测器不匹配。根据样品化学性质调整波长或改换检器

4.检测器衰减太多。调整衰减即可。

5.检测器时间常数太大。解决办法为降低时间参数。

6.检测器池窗污染。解决办法为清洗池窗。

7.检池中有气泡。解决办法为排气。

Q12. 如何进行色谱柱的维护？

解答：

1.建议检测前样品和流动相进行过滤。

2.建议每天做完样品后及时进行清洗。

3.常规检测：测试完后直接把色谱柱反向连接采用90%有机相冲洗45min，最后保存在纯甲醇或纯乙腈中。

4.使用缓冲盐条件：

a.等度条件：使用缓冲盐之前和之后都用过渡流动相以1mL/min流速冲洗45min

b.梯度条件：使用缓冲盐之前与初始流动相组成相同的过渡流动相以1mL/min流速冲洗45min。

注意：过渡流动相是指有机相和水相比例与分析流动相相同比例，只是不含有缓冲盐。

c.缓冲盐冲洗干净后，采用90%有机相反向冲洗60min，最后保存在纯有机溶剂中。

注意：如果使用缓冲液不能存留色谱柱中过夜。

Q13. 规则的基线噪音是如何产生的

解答：

原因

1.在流动相、检测器或泵中有空气(尖锐峰)。

2.漏液。

3.流动相混合不完全。

4.温度影响(柱温过高,检测器未加热)。

5.在同一条线上有其他电子设备(偶然噪声）

6.泵振动

解决方法

1.流动相脱气。冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。

2.检查管路接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要,更换泵密封。

3.用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂。

4.减少差异或加上热交换器。

5.断开LC、检测器和记录仪,检查干扰是否来自于外部,加以更正。采用精密级稳压电源。

6.在系统中加入脉冲阻尼器。

Q14. 不规则的基线噪音是如何产生的

解答：

原因

1.漏液。

2.流动相污染、变质或由低质溶剂配成。

3.流动相各溶剂不相溶

4.检测器/记录仪电子元件的问题

5.系统内有气泡

6.检测器内有气泡

7.流通池污染(即使是极少的污染物也会产生噪音。

8.检测器灯能量不足

9.色谱柱填料流失或阻塞

10.流动相混合不均匀或混合器工作不正常

解决方法

1.检查接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要,更换密封。检查流通池是否漏液。

2.检査流动相的组成。

3.选择互溶的流动相

4.断开检测器和记录仪的电源,检查并更正。

5.用强极性溶液清洗系统

6.清洗检测器,在检测器后面安装背景压力调节器

7.用1N的硝酸(不能用磷酸)清洗流通池

8.更换灯

9.更换色谱柱

维修或更换混合器,在流动相不走梯度时,建议不使用泵的混合装置

Q15. 氨基柱在进酸性样品时，很伤柱子，如使用一段时间后，柱效降低，峰形改变，如何恢复？

解答：用5-10倍的柱体积的含0.5-1.0％NH3的乙腈-水(50:50)溶液冲洗该柱(冲洗后当然要再用不含碱的流动相洗去多余氨)，之后再进行分析这类酸性分析物时建议在流动相中略微添加少许氨如0.1％。

Q16. 做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在？如何解决？

解答：

1.泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理。

2.比例阀失效，更换比例阀即可。

3.泵密封垫损坏，更换密封垫即可。

4.溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法。

5.系统检漏，找出漏点，密封即可。

6.梯度洗脱，这时压力波动是正常的。

Q17. HPLC柱验收测试时柱压过高，请问为什么？

解答：

柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因：

1.拆去保护预柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查。

2.把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查。

3.将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，（此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池）。这时，如果柱压仍不下降，再检查。只用于使用过的柱子。

4.更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系。一般情况下，在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题。

Q18. 流动相出现气泡的原因有哪些？

解答：

1.流动相溶液中往往因溶解有氧气或空气而形成气泡。

2.液路阻力比较大，吸液时出现了真空气泡。

3.系统开始工作时未能将流路中的空气排除干净。

4.在注入样品时混入了空气。