背景

吴茱萸为芸香科植物吴茱萸、石虎或疏毛吴茱萸的干燥近成熟果实，含有大量的挥发油、柠檬苦素类和生物碱类成分，这些成分对GCMSMS和LCMSMS分析中个别农残化合物干扰大且响应较低，农残线性和回收率较差，偶见丢峰。常规的固相萃取法一、固相萃取法二、固相萃取法三都不能很好的净化。纳谱分析近期针对以上含挥发油和生物碱样品分析存在的问题，在改进填料的吸附能力的同时，推出了一种组合前处理方法。相比常规固相萃取方式，优化后的三种固相萃取柱可以有所针对性的吸附更多色素、挥发油、生物碱、树脂类成分，从而降低了样品中色素对色谱柱的污染和生物碱、挥发油类照成目标物响应低、保留时间漂移、丢峰等基质效应，有效的提高了吴茱萸样品分析时农残目标物的响应值。今天，我们来看看吴茱萸项目的前处理效果吧。

适用范围

 本方法参考中国药典2020版2341第五法中的固相萃取法2，适用于含有挥发油、生物碱类基质干扰大和色素较多的中药材农残检测。

实验步骤

1 对照品溶液的制备

1.1 混合对照品配制

   精密量取禁用农药混合1mL，置20mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，备用；

1 .2 气相色谱-串联质谱法分析用内标溶液的制备

取磷酸三苯酯对照品适量，精密称定，加乙腈溶解并制成每1mL含1.0mg的溶液，即得。精密量取适量，加乙腈制成每1mL含0.1μg的溶液。

1.3 空白基质溶液的制备

取空白基质样品，同供试品溶液的制备方法处理制成空白基质溶液。

1.4 基质混合对照溶液的制备

分别精密量取空白基质溶液1.0mL(6份），置氮吹仪上，40°C 水浴浓缩至约0.6mL，分别加入混合对照品溶液l0μL、20 μL、50 μL、100μL、150μL、200μL，加乙腈稀释至lmL，涡旋混匀，即得。

2  供试品溶液的制备

2.1 提取

精密称取5g样品（3号筛），加氯化钠1g，加入50mL乙腈，匀浆处理2分钟，离心后分取上清液，残渣再加50mL乙腈，匀浆处理1分钟，离心后，合并两次提取上清液，减压浓缩至3~5mL，加乙腈定容至10mL，摇匀，置-20℃冷藏3h或家用冰箱冷藏过夜，取出趁冷离心1min(4000转/min)，分取所有上清液置离心管中，摇匀，待净化。

3   净化

GCMSMS样品：

SPE柱：SelectCore HLB-C固相萃取柱 500mg/6mL

净化：取SelectCore HLB-C固相萃取柱 500mg/6mL小柱，加乙腈5mL活化，再取吴茱萸提取液2mL置已活化的SelectCore HLB-C固相萃取柱中，收集样品液，待所有样品液进入柱体填料后，取5mL乙腈洗脱，合并样品液与洗脱液，氮吹至2mL即得。

GC/MS/MS测定：精密量取过固相萃取柱氮吹定容后的溶液1mL，氮吹至0.4mL加入混合对照溶液，乙腈定容至1mL，再加入0.3 mL磷酸三苯酯溶液，混匀，过0.22μm尼龙针式过滤器，上机分析。

注意事项：样品洗脱定容后只有2mL，故需要配置6个浓度点标准曲线时可合并5次分别5根SelectCore HLB-C固相萃取柱 500mg/6mL小柱净化的样品液与洗脱液，40℃以下减压回收至5mL，转移至10mL容量瓶，再取适量乙腈冲洗减压回收瓶并入样品液，定容至10mL。如若做快速样品筛查时可直接将净化的样品液与洗脱液并入10mL已校准的刻度具塞试管中氮吹至2mL即得。

LCMSMS样品：

SPE柱：SelectCore HLB固相萃取柱 500mg/6mL

净化：量取上述吴茱萸提取液3mL，过SelectCore HLB固相萃取柱 500mg/6mL，收集全部净化液，混匀，即得。

LC/MS/MS测定：精密量取过固相萃取柱后溶液1mL氮吹至0.4mL加入混合对照品液，乙腈定容至1mL，再加入0.3 mL水，混匀，过0.22μm尼龙针式过滤器，上机分析。

补充净化办法：（用于吴茱萸LCMSMS中3-羟基克百威、特丁硫磷砜、甲拌磷砜）也可用于除甲胺磷、磺隆类、久效磷以外的化合物联合分析

取：SelectCore GCB/NH₂-A 固相萃取柱，加乙腈：甲苯（3:1）5mL活化，再取吴茱萸提取液2mL置已活化的SelectCore GCB/NH₂-A 固相萃取柱中，用乙腈：甲苯（3:1）15mL洗脱，收集样品液与洗脱液，减压回收至2mL即得。

注意事项：由于SelectCore GCB/NH₂-A 固相萃取柱净化洗脱液中含甲苯，减压回收时应尽量浓缩干一点，减少甲苯残留，甲苯残留量高可能导致个别化合物保留时间提前，配制样品液与基质加标和前加标液时应不加水，由于甲苯与水不溶，可能会导致分层而使分析结果不准确。

4   气相色谱-串联质谱法（岛津 GC-MS -TQ8040 NX）

色谱条件

色谱柱：SHIMADZU SH-Rxi-17Sil MS，30m×0.25mm，0.25μm;

进样口温度：250℃；

升温程序：初始温度为60℃，保持1min；以10℃/min升温至160℃；再以2℃/min升温至230℃，最后以15℃/min升温至300℃，保持6min；

载气：高纯氦气（纯度>99.999%）；

进样方式：不分流进样；

恒压模式：146kPa；

进样量：1μL。

质谱条件

电离方式：电子轰击电离源（EI）；

电离能量：70Ev；

接口温度：250℃；

离子源温度：250℃；

监测方式：多反应检测模式（MRM）；

溶剂延迟：10.0min。

GCMSMS监测目标物注意事项：

甲基对硫磷定量离子：263.10>109.00  CE：13  参考离子：125.00>47.00  CE：10

地虫硫磷定量离子：245.90>137.00  CE:5 参考离子：245.90>109.00  CE:15     保留时间(参考):16-19min与γ-666保留时间接近。

久效磷参考LCMSMS分析结果。

经过SelectCore HLB-C处理后的吴茱萸样品，GCMSMS分析化合物均无干扰，且氟虫腈类化合物保留时间均无漂移。

5   高效液相色谱-串联质谱法（岛津 LC-MS 8045）

色谱条件

色谱柱：ChromCore C18-MS Pesticides中药农残专用柱(2.1 ×100 mm，2.6 μm)

流动相：

A：0.1%甲酸水溶液（含有5mmol/L甲酸铵）

B：乙腈-0.1%甲酸水溶液（含有5mmol/L甲酸铵）=95:5

流速: 0.3 mL/min

柱温: 40 ℃

进样量: 2 µL

梯度：

质谱条件

离子源: 电喷雾离子源（Electrospray ionization，ESI）正离子扫描

监测方式：多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）

离子源接口电压：4.5kV

雾化气：氮气3.0L/min

加热气：干燥空气10.0L/min

DL温度：250℃

加热模块温度：400℃

接口温度：300℃

干燥气：N₂ 10 L/min

LCMSMS监测目标物注意事项：

吴茱萸基质中3-羟基克百威和甲拌磷砜响应较低，在 样品出现阳性或线性达不到要求时采用上述补充净化办法来联合分析，补充净化办法净化的吴茱萸基质中3-羟基克百威和甲拌磷砜响应较为良好。

3-羟基克百威定量离子为：238.1>163.1

挥发油基质样品自动进样器托盘温度不宜过低，否则个别样品会出现分层，导致分析结果不准确，建议25℃为宜。

地虫硫磷参考GCMSMS分析结果LCMSMS可不分析此化合物

甲基异柳磷参考GCMSMS分析结果

蝇毒磷参考GCMSMS分析结果

杀虫脒参考GCMSMS分析结果

由于吴茱萸基质复杂，且目标物在吴茱萸基质中干扰情况为基质减弱，响应低，为提高仪器灵敏度，建议LCMSMS样品分析时采用分段采集的办法，分段采集设置时间段为各目标物保留时间前后0.5min即可。

表1  吴茱萸中33种农药残留的的测定添加回收结果（%）

6  处理后溶液的颜色比对

7  吴茱萸普通固2柱与HLB-C柱净化的CGMSMS数据分析图

吴茱萸普通固2柱与GCB/NH₂-A柱净化的LCMSMS数据分析图

8 实验讨论

通过以上实验对比数据可以看出，SelectCore HLB-C 500mg/6mL小柱净化后的吴茱萸样品溶液颜色较浅，减少了污染GCMSMS柱前端的风险，且GCMSMS上样品中所有化合物均无干扰，蝇毒磷响应提高了6倍、硫丹硫酸酯响应提高了8倍、δ-六六六响应提高了5倍、苯线磷响应提高了5倍。SelectCore HLB 500mg/6mL固相萃取柱对吴茱萸中挥发油类成分祛除效果良好，减轻了由于基质中干扰物导致的LCMSMS上样品中部分目标物响应低的问题。SelectCore GCB/NH₂-A 500mg/500mg/6mL解决了3-羟基克百威和甲拌磷砜响应低，丢峰的问题，3-羟基克百威响应提高了10倍。这三款农残专用固相萃取柱，针对吴茱萸中大量色素、挥发油和生物碱类成分去除效果良好，极大的消除了由于基质效应带来的甲基异柳磷、α-硫丹、硫丹硫酸酯、δ-六六六、蝇毒磷、氟虫腈类农残成分的响应低、目标物线性不好、保留时间漂移、回收率差的问题，为吴茱萸的农药残留实验数据的稳定性和可靠性提供了良好的帮助。